即用型PCR試劑盒（染料法）

注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時(shí)間；4．循環(huán)次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗過(guò)程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長(cháng)期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設立一個(gè)的PCR實(shí)驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jì)Υ?，從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
二甲氨基甲酸(>98.0%(HPLC)(T))E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb2-氧代環(huán)戊基酸酯

5-(甲氧羰基基)-10,15,2-三基卟吩(>90.0%(HPLC))E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb5-硝基吲哚-2-酮

2-萘甲酸(>98.0%(GC)(T))Basic FGF (19A9) Rabbit mAb2-噻吩

2-萘甲酰(>98.0%(GC)(T))EGF Receptor (L858R Mutant Specific) (43B2) Rabbit mAb2-氟-溴-5-氨基吡啶

甲酸(>99.0%(GC)(T))PKM2 Antibody2-氨基腺嘌呤核苷

聯(lián)基-羧酸(>98.0%(T))E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)2,4,5-三氟

基甲酰(>98.0%(GC)(T))SynGAP Antibody氨基-5-氟吡啶

二甲基氨基肉桂(>98.0%(T))Yes Antibody2-氟三氟甲氧基

2,萘二羧酸酐(>95.0%(GC)(T))eNOS (D9A5L) Rabbit mAb-2-氟

N-(叔丁氧羰基)-1,2-二氨基烷(>97.0%(GC))Androgen Receptor Antibody2--氟

[(叔丁氧羰氨基)甲基]吡啶-2-羧酸(>96.0%(HPLC)(T))CDK9 (C12F7) Rabbit mAb (PE Conjuga)5,6-二甲氧基茚酮

雙(鋅卟啉)(約5μmol/L的二溶液) Phospho-IRS-1 (Ser612) (C15H5) Rabbit mAb肉桂基

雙(鋅卟啉)(約5μmol/L的二溶液)Phospho-IRS-1 (Ser612) (C15H5) Rabbit mAb溴聯(lián)

五亞甲基雙[(10,15,20-三卟吩-5-基)甲酸]二鋅(Ⅱ)(>97.0%(HPLC))Pyruva Dehydrogenase (C54G1) Rabbit mAb6-溴吡啶-2-羧酸酯

全氟三丁(>60.0%(GC))Pyruva Dehydrogenase (C54G1) Rabbit mAbN,N,N',N'-四甲基-S-(1-氧代-2-吡啶基)硫脲六氟酸鹽

2,4,6-三(十五氟庚基)-1,3,5-三(>98.0%(GC))GPX1 Antibody二甲氨基酮

2,4,6-三(五氟基)-1,3,5-三(>95.0%(GC))AMACR (2A10) Mouse mAb5-氨基-1H-咪唑-酰

2,4,6-三(七氟基)-1,3,5-三(>98.0%(GC))AP-2α Antibody2-氧基酸

雞L氨酸解氨酶(PAL)ELISA試劑盒phospho-PKC delta (Thr505)  酸化蛋白激酶C亞性D型100 ul

雞HSP90(IgM)ELISA試劑盒phospho-PKC delta (Tyr311)  酸化蛋白激酶C亞性D型20 ul

雞HSP90(IgG)ELISA試劑盒PLAU/uPA  尿激酶型纖溶酶原激活因子100 ul

雞HSP72(IgM)ELISA試劑盒PLAUR  尿激酶型纖溶酶原激活因子受體100 ul

雞HSP72(IgG)ELISA試劑盒PLG  纖維蛋白溶酶原100 ul

雞HSP60(IgM)ELISA試劑盒Plexin A1  神經(jīng)叢蛋白A1100 ul

雞HSP60(IgG)ELISA試劑盒Plexin A2  神經(jīng)叢蛋白A2100 ul

雞HSP27(IgG)ELISA kiPlexin B1  神經(jīng)叢蛋白B11 Kit

雞HSP27 IgM ELISA試劑盒Plectin  網(wǎng)蛋白100 ul
即用型PCR試劑盒(染料法)ASTE1蛋白抗體Tetrahydropalmatine中文名：延胡索乙素別名：(+)-Tetrahydropalmatine; 右旋四氫巴馬汀分子式：C21H254

錨蛋白重復結構域蛋白17抗體L-Carnitine中文名：左旋肉堿別名：分子式：C7H153

胞質(zhì)乙醛脫氫酶1抗體Glutathione中文名：谷胱甘肽別名：分子式：C10H17N3O6S

ADP核糖基化樣因子ARL3抗體Melatonin中文名：褪黑素別名：分子式：C13H16N2O2

內收蛋白a1抗體Dehydroevodiamine hydrochloride中文名：去氫吳茱萸堿鹽酸鹽別名：分子式：C19H16N3O
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照)，每個(gè)測試反應體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應加入的量 N個(gè)反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個(gè)PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽(yáng)性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。